Kev Kawm Ua Ntej Ntshai Ua Ntej Ua Tau Zoo Tshaj Plaws Ntawm Kev Ntshai Ntshai Tshiab Ncaj Ncees rau hauv Cortical Networks Part 3
Sep 25, 2023
Kev sim tsim
Cov ntaub ntawv rov tsim dua tau raug soj ntsuam nrog sib txawv replicates (S1 Table). Thawj CNQX inactivation thwmsim nyob rau hauv Te2 (Daim duab 1A–1C) tau ua nyob rau hauv ib tug ntau dua ntawm replicates vim hais tias lawv yog thawj thwmsim uas peb tau ua thiab ua hauj lwm los ntsuam xyuas qhov loj hypothesis ntawm peb txoj kev tshawb no. Tsiaj txhu yog ib qho tseem ceeb rau pawg coj cwj pwm sib txawv hauv qhov hnyav-sib npaug. Cov txiv neej tsiaj los ntawm tib tug brood raug random muab rau txhua pawg sim. Peb thawj zaug hais txog lub ntsiab lus ntawm peb txoj kev tshawb fawb, piv txwv li, cortical inactivation tuaj yeem cuam tshuam rau kev sib koom ua ke ntawm kev ntshai tshiab nco hauv kev sim cov nas tsis zoo thiab hauv cov tsiaj uas tau kawm txog qhov kev ntshai ua ntej.
Cov txiv neej tsiaj muaj kev nco zoo heev vim tias lawv muaj kev muaj sia nyob muaj zog thiab muaj lub siab xav rov tsim dua. Cov tsiaj muaj sia nyob hauv cov tsiaj qus yuav tsum nco ntsoov ntau cov ntaub ntawv ntawm thaj chaw, hom zaub mov, cov tsiaj txhu, thiab cov chaw ntawm cov tswv cuab kom hloov tau zoo rau ib puag ncig thiab tiv thaiv lub neej.
Piv txwv li, cov txiv neej tsov ntxhuav yuav tsum nco ntsoov cov xwm txheej ntawm tag nrho cov cheeb tsam, kev sib raug zoo ntawm cov tswv cuab, thiab cov chaw ntawm cov neeg sib tw los tiv thaiv thaj chaw thiab lawv cov xwm txheej. Txiv neej zebras yuav tsum nco ntsoov qhov chaw ntawm cov dej thiab zaub mov ntawm cov nyom kom muaj sia nyob thiab yug me nyuam. Ib lub tuam txhab dej qab zib ib zaug tau khiav ib qho kev tshaj tawm qhia tias tus txiv neej polar dais tuaj yeem nco txog tus neeg dhia dej thiab nws cov ntxhiab tsw txawv txav kom nws tuaj yeem txheeb xyuas nws lwm zaus lawv pom nws.
Yog li ntawd, cov txiv neej tsiaj yuav tsum muaj kev nco zoo txog kev tiv thaiv lawv thaj chaw, muab zaub mov txaus, thiab tsim cov xeeb ntxwv. Qhov no kuj ua rau lawv cov ntsiab lus tseem ceeb hauv kev tshawb fawb tib neeg, piv txwv li, txhawm rau tshawb xyuas cov kab mob xws li kev nco tsis zoo thiab Alzheimer's disease.
Hauv tib neeg ntiaj teb, peb kuj tuaj yeem txais kev tshoov siab los ntawm kev nco txog txiv neej tsiaj. Kev tsis tu ncua ntawm cov khoom tshiab, kev kawm tas mus li, thiab kev xav tuaj yeem txhim kho peb lub cim xeeb thiab hloov tau, thiab txhim kho peb cov qauv kev ua neej thiab kev ua haujlwm. Yog li ntawd, cia peb kawm los ntawm cov txiv neej tsiaj, txuas ntxiv mus sau cov kev paub thiab kev paub, muaj zog ciaj sia taus instincts thiab kev ntshaw kev yug me nyuam, thiab tsim lub neej yav tom ntej zoo dua. Nws pom tau tias peb yuav tsum txhim kho peb lub cim xeeb. Cistanche deserticola tuaj yeem txhim kho kev nco zoo vim Cistanche deserticola yog cov khoom siv tshuaj suav tshuaj suav nrog ntau yam tshwj xeeb, ib qho ntawm kev txhim kho kev nco. Kev ua tau zoo ntawm cov nqaij minced los ntawm ntau yam khoom xyaw uas nws muaj, nrog rau cov kua qaub, polysaccharides, flavonoids, thiab lwm yam. Cov khoom xyaw no tuaj yeem txhawb lub hlwb kev noj qab haus huv ntau txoj hauv kev.
Nyem paub txoj hauv kev los txhim kho lub hlwb
Nyob rau hauv cov ntaub ntawv ntawm kev txheeb cais sib txawv ntawm cov pab pawg no, peb ces nws thiaj li ua ntxiv tswj pab pawg los ntawm kev txhaj tshuaj saline. Ib txoj hauv kev zoo sib xws tau siv rau qhov kev sim optogenetic, qhov twg AAV-tswj pab pawg tau ua tiav tsuas yog tom qab kev txheeb xyuas qhov sib txawv ntawm qhov tsis zoo thiab cov nas uas tau kawm yav dhau los raug kuaj pom. Cov sijhawm sim no tau tso cai rau peb kom tsis txhob muaj pawg tswj hwm tsis tsim nyog thiab siv cov tsiaj tsis tsim nyog, qhov teeb meem tseem ceeb hauv European thiab Italian txoj cai lij choj ntawm kev sim tsiaj (3 Rs txoj cai).
Cov txheej txheem coj cwj pwm
Txhua qhov kev sim tau ua thaum lub teeb ci ntawm hnub (8 teev sawv ntxov txog 4 teev tsaus ntuj). Tsiaj txhu tau raug thauj los ntawm qhov chaw mus rau chav sim hauv cov thoob me me sib txawv raws li qhov xav tau ntawm kev sim.
Kev cob qhia Auditory: Thawj zaug kev coj cwj pwm. Cov tsiaj txhu muaj kev ntshai (CS1-CS2). Hauv pab pawg no, cov nas tau maj mam muab los ntawm lawv lub tawb hauv tsev thiab nqa los ntawm chav tsev nyob mus rau chav tsis muaj suab nrov. Thaum muaj, cov tsiaj tau muab tso rau hauv lub tshuab txias uas muaj lub tawb dub (35 × 40 cm) nruab nrog cov kab hlau tsis muaj steel hlau (1 cm inch, spaced 1.5 cm sib nrug) txuas nrog kev teeb tsa kev poob siab.
Cov nas tsuag tau tso tseg tsis muaj teeb meem rau 1 feeb. Tom qab lub sij hawm no, 7 conditioned stimuli (CSs) uas muaj lub suab ntshiab ntawm 15 kHz ntawm zaus (15 s ntawm lub sij hawm txhua, 80 dB, 36 s trials interval) tau tswj hwm. Qhov kawg 1 s ntawm txhua lub suab tau ua ke nrog kev mob US (0.5 mA, 1 s). Thaum kawg ntawm qhov kev kho mob, cov nas raug coj rov qab mus rau lawv lub tsev tawb.
Shock-tsuas tsiaj (shock-CS2). Hauv pab pawg no, nas tau zoo sib xws rau hauv tib lub tshuab txias txias. Tam sim ntawd tom qab ntawd, txhua tus nas tau raug 7- ko taw shocks (1 s, 0.5 mA) ib zaug tom qab. Thaum kawg ntawm qhov kev txhawb siab, cov tsiaj raug coj rov qab mus rau lawv lub tsev tawb. Lub sij hawm ruaj khov nyob rau hauv lub tawb txias yog tsawg dua 9 vib nas this. Cov kev tshawb fawb yav dhau los tau pom tias cov txheej txheem no tso cai rau zam kev sib koom ua ke ntawm kev mob stimuli thiab kev hnov mob [29,30].
Cov tsiaj uas muaj ntxhiab tsw ntshai (tso-CS2). Hauv pab pawg no, cov nas tau muab tso rau hauv tib lub tawb dub ua haujlwm hauv cov pab pawg sim saum toj no thiab txuas nrog kev teeb tsa kev poob siab. Cov nas tau tso tseg tsis muaj kev cuam tshuam rau 2 min. Tom qab lub sijhawm no, 7 CSs uas muaj cov ntxhiab tsw qab zib tau raug tswj hwm (10 s ntawm lub sijhawm txhua, 24 s sijhawm sim). Qhov kawg 1 s ntawm txhua tus ntxhiab tau ua ke nrog kev mob US (0.5 mA, 1 s). Lub tshuab ua kom txias tau muab tso rau ze ntawm qhov chaw ua pa kom tsis txhob muaj kev pheej hmoo ntawm kev xa tawm tom qab lawv offset. Lub tawb tau ensured nrog ib daim phiaj sab sauv. Cov ntxhiab tsw tau nthuav tawm uas siv lub flow-dilution olfactometer. Cov huab cua huv huv (1.5 L / min) raug coj mus rau lub solenoid valve, uas thaum ua haujlwm, xa huab cua mus rau 15 ml lub raj mis uas muaj 10 ml ntawm vanilla tsw.
Tone-tsuas yog tsiaj txhu (Tone-CS2). Cov nas tsuag hauv pawg no tau muab tso rau hauv tib lub tawb dub thiab tau nthuav tawm nrog 15-kHz suab (7 stimuli, 15 s ntawm lub sijhawm, 36 s ITI) xa tawm thaum tsis muaj Tebchaws Meskas.
Cov tsiaj ua ntej nthuav tawm (Tone-CS1-CS2). Cov nas tsuag tau muab tso rau hauv lub tawb txias thiab, 1 min tom qab, lawv tau nthuav tawm 20 zaug nrog lub suab ntawm 15-kHz ib leeg, thiab 24 teev tom qab ntawd tib lub suab tau ua ke nrog Asmeskas dhau los ua CS1.
Dawb suab ntshai-conditioned tsiaj (WN-CS2). Hauv pab pawg no, nas tau muab tso rau hauv lub tawb dub thiab sab laug tsis muaj kev cuam tshuam rau 1 feeb. Tom qab lub sijhawm no, 7 CSs suav nrog WN (15 s ntawm lub sijhawm txhua, 75 dB, 36 s kev sib tw sib tw) tau muab. Qhov kawg 1 s ntawm txhua lub suab tau ua ke nrog kev mob US (0.5 mA, 1 s). Thaum kawg ntawm qhov kev kho mob, cov nas raug coj rov qab mus rau lawv lub tsev tawb.
Auditory ntshai kawm: Kev cob qhia tus cwj pwm thib ob. Ob lub lis piam tom qab cov txheej txheem tau piav qhia nyob rau hauv kab lus saum toj no, cov tsiaj tau raug cob qhia hauv lwm qhov sib txawv ntawm kev ntshai kev ua haujlwm. Cov nas tsuag tau muab tso rau hauv lub thawv tawv nqaij, ib yam li hauv peb txoj haujlwm dhau los [10], thiab sab laug tsis muaj teeb meem rau 2 min. Tom qab lub sijhawm no, 7 CSs uas muaj cov suab nrov ntawm 3 kHz ntawm zaus (8 s ntawm lub sijhawm txhua, 80 dB, 22 s kev sib tw sib tw) raug xa tawm. Qhov kawg 1 s ntawm txhua lub suab tau ua ke nrog kev mob US (0.5 mA, 1 s). Thaum kawg ntawm qhov kev kho mob, cov nas raug coj rov qab mus rau lawv lub tsev tawb.
Ntshai nco khaws cia. Kev khaws cia ntawm kev ntshai kev nco tsis ntev los no tau txais rau CS2 (3 kHz) tau sim 4 hnub tom qab. Rau kev sim optogenetics, qhov kev sim ntawm lub cim xeeb tsis ntev los no tau ua nrog laser xa 24 teev tom qab CS2-US kev kawm hauv kev sib piv rau lub sijhawm uas peb tau ua cortical inactivation los ntawm kev tswj hwm ntawm CNQX (ie, 24 teev tom qab kev cob qhia). Cov nas tau nyob hauv ib lub cuab yeej sib txawv ntawm qhov uas siv rau kev txias thiab muab tso rau hauv ib chav sib txawv kom tsis txhob muaj kev ntshai tus cwj pwm rau cov ntsiab lus cues [10,62].
Cov cuab yeej tshiab no muaj lub tawb yas pob tshab nrog rau sab pleev xim dub nyob rau hauv lub thawv suab-attenuating nruab nrog lub kiv cua tawm, uas tshem tawm cov ntxhiab tsw ntawm lub qhov rooj thiab muab lub suab nrov tom qab ntawm 60 dB. Tsiaj txhu tau tso cai los tshawb txog lub tawb rau 5 feeb ib hnub thaum lub sijhawm ua neej nyob. Nyob rau hnub ntawm kev ntshai nco kev sim, tom qab 2 min ntawm kev tshawb nrhiav dawb, peb xa 4 CS2 ntawm 3 kHz (8 s-22 ITI) tsis ua raws li Asmeskas.
Yog tias xav tau los ntawm qhov kev sim xav tau, cov nas tau raug sim rau kev khaws cia ntawm cov chaw taws teeb ntshai kev nco, tau txais 2 lub lis piam ua ntej qhov thib ob auditory ntshai txias sim. Rau lub hom phiaj no, 7 hnub tom qab qhov kev ntshai nco txog kev sim mus rau 3-kHz suab, cov tsiaj tau muab tso rau hauv ib puag ncig tshiab (lub tawb dub thiab dawb kab txaij) thiab tom qab ntawd nthuav tawm nrog 15-kHz suab. Plaub lub suab tau nthuav tawm ntawm 36s ntu.
Kev cob qhia cov ntsiab lus: Thawj zaug kev coj cwj pwm. Contextual ntshai conditioning group (CtxA-CtxB). Hauv pab pawg no, cov nas tsuag tau maj mam muab los ntawm lawv lub tawb hauv tsev, muab tso rau hauv lub thoob, thiab nqa los ntawm chav tsev mus rau chav tsis muaj suab nrov. Thaum nyob ntawd, cov tsiaj tau muab tso rau hauv lub tshuab cua txias uas muaj cov lus hais saum toj no cov duab plaub lub tawb dub, nruab nrog cov kab hlau tsis muaj steel hlau txuas nrog rau kev teeb tsa kev poob siab. Cov nas tsuag tau tso tseg tsis muaj teeb meem rau 1 feeb. Tom qab lub sijhawm no, 5 US (0.5 mA, 1 s) tau tswj hwm nrog 51 s lub sijhawm sib txawv. Thaum kawg ntawm kev sib tham, cov tsiaj raug coj rov qab mus rau lawv lub tsev tawb.
Shock-tsuas yog pawg (poob siab-CtxB). Cov nas tsuag, ib zaug tso rau hauv lub tshuab txias, tau txais tam sim ntawd 5- ko taw shocks (1 s, 0.5 mA) ib qho tam sim ntawd tom qab lwm qhov. Lub sijhawm ruaj khov hauv lub tawb txias yog tsawg dua 7 vib nas this. Cov kev tshawb fawb yav dhau los tau pom tias cov txheej txheem no tso cai rau zam kev sib koom ua ke ntawm kev mob stimuli thiab kev hnov mob [29,30].
Shock-tsuas yog pawg (poob siab-CtxB). Cov nas tsuag, ib zaug tso rau hauv lub tshuab txias, tau txais tam sim ntawd 5- ko taw shocks (1 s, 0.5 mA) ib qho tam sim ntawd tom qab lwm qhov. Lub sijhawm ruaj khov hauv lub tawb txias yog tsawg dua 7 vib nas this. Cov kev tshawb fawb yav dhau los tau pom tias cov txheej txheem no tso cai rau zam kev sib koom ua ke ntawm kev mob stimuli thiab kev hnov mob [29,30].
Tshiab contextual ntshai txias txias thiab tsis ntev los no ntshai nco nco. Ob lub lis piam tom qab cov txheej txheem tau piav qhia hauv kab lus saum toj no, txhua pab pawg tau raug cob qhia los koom nrog ib puag ncig tshiab (lub thawv tawv nqaij, muab tso rau hauv ib chav sib txawv) nrog kev mob US (0.5 mA, 1 s) . Txhua tus tsiaj tau muab tso rau hauv lub chamber tshiab thiab sab laug tsis muaj kev cuam tshuam rau 2 feeb. Tom qab ntawd, nws tau raug 5 US sib cais los ntawm 30 s.
Kev khaws cia ntawm cov ntsiab lus ntawm kev ntshai nco tau raug sim 4 hnub tom qab qhov kev ntshai txias txias los ntawm kev tso nas dua rau hauv Skinner box chamber rau 3 min. Rau kev sim optogenetics, qhov kev sim ntawm kev nco tsis ntev los no tau ua nrog laser xa 24 teev tom qab CtxB-US kev kawm hauv kev sib piv rau lub sijhawm uas peb tau ua cortical inactivation los ntawm kev tswj hwm ntawm CNQX (ie, 24 teev tom qab kev cob qhia). Yog tias xav tau los ntawm qhov kev xav tau, cov nas tau raug sim rau kev khaws cia ntawm cov chaw taws teeb ntshai kev nco los ntawm kev muab tsiaj tso rau hauv cov ntsiab lus sib koom ua ke rau Asmeskas 2 lub lis piam ua ntej lub koom haum tshiab.
Tsiaj txhu tau nqa hauv 2 lub thoob sib txawv mus rau chav txias raws li cov txheej txheem sib txawv.
Kev ntsuas khov. Hauv tag nrho cov txheej txheem sim, qhov kev ntsuam xyuas ntawm kev ntshai kev cia siab tau txiav txim siab raws li cov lus teb khov kho [10], txheeb xyuas raws li qhov tsis muaj tag nrho ntawm somatic kev txav mus los tshwj tsis yog kev ua pa ua pa. Rau txhua tus tsiaj, tus nqi ntawm lub sijhawm (hauv vib nas this) siv nyob rau hauv khov yog ntsuas offline los ntawm 2 tus neeg saib xyuas ywj pheej uas tau ua rau qhov muag tsis pom ntawm cov tsiaj.
Cov txheej txheem phais
Txhawm rau tswj hwm cov tshuaj uas tau xaiv hauv cov phiaj xwm phiaj xwm, cov nas tau muab tshuaj loog nrog isoflurane: qhov induction tau ua ntawm 4% [vol / vol] hauv 2 L / min kho cua thiab txuas ntxiv mus rau qhov kis mus tas li ntawm 2% [vol / vol]) thaum nas tau mounted nyob rau hauv lub stereotaxic apparatus.
Ib qho kev txiav ntawm lub pob txha taub hau tau ua, thiab cov burr qhov me me tau raug laum kom tso cai rau kev nkag mus ntawm 28- ntsuas koob txhaj tshuaj. Ib tug 10-ul Hamilton syringe mounted ntawm lub twj tso kua mis infusion tau siv los xa cov khoom. Tom qab infusions, koob tau tso rau hauv qhov chaw ntxiv rau 3 feeb. Tom qab ntawd qhov kev phais raug kaw nrog stainless hlau qhov txhab clips, thiab tus tsiaj tau txhaj tshuaj subcutaneous ntawm analgesic / anti-inflammatory ketoprofen (2 mg / kg lub cev qhov hnyav), thiab tus tsiaj tau khaws cia sov thiab saib xyuas kom txog thaum rov qab los ntawm kev siv tshuaj loog.
Raws li nyob rau hauv yav dhau los kev tshawb fawb [10,32–34], lub cannulation ntawm cov tsiaj yog tsis tsim nyog, nrog rau cov active compounds yog ncaj qha tswj stereotaxically. Cov txheej txheem no yog qhov muaj txiaj ntsig zoo vim tias kev phais mob tshwm sim los ntawm cov txheej txheem mus tas li-cannulating raug zam, yog li txwv kev raug mob rau ib rab koob nkag mus [10,32–34]. Tseeb tiag, kev tshuaj loog dav dav tsis cuam tshuam rau kev nco ua ke [10,32–34]. Txhawm rau kom ntseeg tau tias lub sijhawm ntawm kev tswj hwm kev sib txuas cuam tshuam nrog kev sim kev kawm yog qhov tseeb kom cov nas tau txais cov kev xaiv sib txuas nyob ib puag ncig 1 h thiab ib puag ncig 1 hnub tom qab kev cob qhia, isoflurane anesthesia raug ntxias 5 min ua ntej lub sijhawm ntawm kev npaj txhaj tshuaj, piv txwv li, ntawm 55. min hauv nas kho 60 min tom qab kev cob qhia thiab 23 h thiab 55 min hauv cov tsiaj txhaj tshuaj ntawm 24 teev tom qab kev cob qhia. Txhua tus nas tau txias thiab tom qab ntawd ua haujlwm sib cais. Tsiaj txhu teej tug mus rau pawg coj cwj pwm txawv tau manipulated nyob rau hauv ib txoj kev interleaved.
Kev xaiv inhibitor ntawm AMPA/kainate glutamate receptors CNQX ({{{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] tau yaj hauv sterile saline tov (NaCl, 0.9%) thiab kho rau pH 7.4 nrog HCl. Cov protein synthesis inhibitor anisomycin (Merck, 125 ug / ul) tau yaj nyob rau hauv equimolar HCl, diluted nrog sterile saline, thiab hloov mus rau pH 7.4 nrog NaOH. Sterile saline (0.9% NaCl) tau siv los tswj lub tsheb. Cov tshuaj no tau txhaj tshuaj ob sab ntawm tus nqi ntawm 0.1 ul / min thiab ntim ntawm 0.5 ul ib qhov chaw ntawm cov kab ke hauv qab no stereotaxic coj los ntawm Paxinos thiab Watson atlas [26], nrog Te2 cortical teb xa mus rau Zilles atlas [25]:
Secondary auditory cortex (Te2): 1) AP: −5,8 L: ± 7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.
anterior cingulate cortex (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.
Qhov ntim ntawm kev txhaj tshuaj (0.5 ul ib qhov chaw) raug xaiv raws li kev tshawb fawb yav dhau los uas cov tshuaj nquag tau txhaj hauv Te2 [10,34] thiab ACC [55,63] hauv cov nas laus.
Txhawm rau inactivate lub dorsal hippocampus, active compounds raug txhaj ntawm ib ntim ntawm 0.6 ul ib qhov chaw ntawm cov nram qab no stereotaxic coordinates:
Dorsal Hippocampus: 1) AP: −2,8 L: ± 1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ± 2,6 DV: −3.
Cov kab mob irreversible ntawm dorsal hippocampal raug ntxias los ntawm kev tswj hwm NMDA (Tocris, 18 ug / ul, yaj hauv sterile saline tov, 0,4 ul ib qhov chaw) ntawm tus nqi ntawm 0.1 ul/ min ntawm cov ntsiab lus ntawm cov kab ke hais saum toj no. Tib qhov kev sib koom tes tau siv rau kev tswj hwm kev txhaj tshuaj ntsev thiab sham-ua cov tsiaj.
Liab Retrobeads (Lumafluor, 1:2 dilution hauv saline, 0.6 ul) tau txhaj rau hauv BLA raws li cov haujlwm hauv qab no: AP: −2.8; L: ± 5.4; DV: – 8.3.
Thaum kawg ntawm qhov kev sim, cov koob lem nyob rau hauv cov ntaub ntawv ntawm CNQX, anisomycin, los yog saline txhaj los yog txuas ntxiv ntawm qhov txhab nyob rau hauv cov ntaub ntawv ntawm NMDA txhaj tshuaj tau soj ntsuam histologically. Cov nas tsuag tau muab tshuaj loog thiab intracardially perfused nrog 4% formaldehyde. Lawv lub hlwb tau muab faib rau ntawm 30 μm ntawm lub cryostat. Nissl-stained serial sections tau npaj siv cov txheej txheem ib txwm ua thiab cov ntu tau txheeb xyuas histologically nyob rau hauv lub tshuab ntsuas qhov loj ntawm 2.5 ×.
Optogenetic kev sim
Kev txhaj tshuaj. Tus kab mob adeno-associated AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry thiab tswj vector AAV5:CaMKII -cherry tau txais los ntawm University of North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, United States of America). The theseentenceViraltiterwas5:8 Viral titer yog 5.8 × 10^12 vg/ml rau ob tus kab mob. Kev siv CaMKII tus txhawb nqa ua rau cov kev qhia transgene nyiam cov pyramidal neurons. Cov kab mob tau nyob hauv −80˚C lub freezer. Viral infusions tsom rau Te2 lossis ACC tau ua nyob rau saum toj no stereotaxic kev tswj hwm ntawm qhov ntim ntawm 0.5 ul rau txhua qhov. Tus kab mob no tau txhaj ntawm tus nqi ntawm 0.1 ul / min, thiab rab koob raug tso rau hauv qhov chaw ntxiv 5 min. Kev txhaj tshuaj tiv thaiv kab mob tau ua 4 lub lis piam ua ntej kev sim optogenetics.
Teeb pom kev zoo.
Cov fibers optic (Plexon, 200/230 μm tub ntxhais; 10 hli ntev) tau cog ob sab hauv BLA (AP=−2.8, L=± 5.4, V=−8.2 mm. los ntawm bregma). Optogenetic inhibition ntawm Te2 qhov projections rau BLA lossis ntawm ACC qhov projections rau BLA tau txais los ntawm kev siv PlexBright Optogenetic Stimulation System ua ke rau lub laser diode (Laserglow Technologies). Lub teeb daj (589 nm) yog tsim thiab dhau los ntawm fiber ntau optical. Lub zog ceev kwv yees ntawm qhov kawg ntawm cov fiber ntau optic yog 10 mus rau 15 mW rau lub teeb pom kev ntawm qhov chaw projection. Thaum lub sij hawm ntshai kev nco qab, lub teeb emission pib 4 s ua ntej lub suab pib, txuas ntxiv mus thoob plaws lub suab, thiab raug tso tseg 4 s tom qab lub suab offset. Tsiaj txhu uas koom nrog cov pab pawg ntshai tsam tau txais kev txhawb nqa lub teeb thaum lub sijhawm tshawb nrhiav tag nrho (3 min). Cov nas tsuag tau paub txog cov hlua txuas rau 2 hnub ua ntej qhov kev sim khaws cia.
Immunohistochemistry. Tom qab ua tiav cov kev sim tshuaj optogenetics, cov nas tau muab tshuaj loog tob tob thiab perfused intracardially nrog 4% PAF los tshuaj xyuas qhov sib kis ntawm tus kab mob. Cov paj hlwb raug muab tshem tawm, khaws cia rau hmo ntuj ntawm 4˚C, thiab thaum kawg hloov mus rau 30% sucrose. Coronal seem (30 μm) raug txiav rau ntawm lub cryostat thiab sau rau hauv PBS. Free-floating seem tau incubated nyob rau hauv ib qho kev daws teeb meem rau 1 h ntawm RT. Tom qab ntawd, lawv tau tsim nyob rau hauv thawj monoclonal nas antibody anti mCherry (1: 500 dilution, Abcam) nyob rau hauv cov tshuaj tiv thaiv thaum hmo ntuj ntawm RT. Tom qab ntawd, ntu tau ntxuav nrog PBS thiab incubated rau 1 teev ntawm RT nrog ib tug thib ob fluorescent AlexaFluor-568 anti-nas antibody (1:600, Invitrogen) diluted hauv PBS. Cov seem raug ntxuav hauv PBS, mounted nrog cov xov xwm mounting uas muaj DAPI (Vector), thiab cov ntaub npog.
Lub hlwb ntawm cov nas uas tau txhaj tshuaj NMDA tau zoo sib xws. Dawb-floating seem, tom qab ob peb yaug, tau incubated nrog thawj monoclonal nas anti-Neun (1: 1, 000 dilution, Merck) antibody nyob rau hauv cov tshuaj thaiv thaum hmo ntuj ntawm chav tsev kub. Tom qab ntawd, ntu tau ntxuav nrog PBS thiab incubated rau 1 h ntawm chav tsev kub nrog biotinylated nees anti-nas antibody (1: 200 dilution, Vector). Cov avidin-biotin complex (ABC complex 1:100, Vector, 2 h thiab ib nrab ntawm incubation) tau ua ke rau diaminobenzidine (0.03%, Merck) kom stain Neun. Cov seem tau muab yaug hauv PBS thiab xa mus rau gelatin-coated slides, lub cev qhuav dej, thiab npog nrog ib daim ntaub npog.
Te2 ntu ntawm retro hlaws-txhaj nas tsuag tau incubation nrog thawj polyclonal luav anti-Fos antibody (1: 2, 000, Cell Signaling) nyob rau hauv cov tshuaj tiv thaiv thaum hmo ntuj ntawm RT. Tom qab ntawd, cov hlais tau ntxuav nrog PBS thiab incubated rau 1 teev ntawm RT nrog cov tshuaj tiv thaiv luav Alexa 488 (1: 1, 000, Invitrogen, hauv PBS). Thaum kawg, cov seem immunolabeled tau ntxuav hauv PBS, mounted ntawm gelatin-coated slides, thiab npog nrog DAPI-ntxiv mounting nruab nrab.
Microscopy
mCherry labeling raug tshuaj xyuas los ntawm kev siv lub Zeiss Airyscan confocal microscope: Ob lub lasers tau siv (405 thiab 561 nm), txhua qhov sib xws rau lub ncov emission spectrum rau DAPI (Nissl stain rau cell nuclei) thiab Alexa 568 (mCherry ), raws. Txhawm rau txheeb xyuas qhov sib kis ntawm tus kab mob ntawm qhov chaw txhaj tshuaj, micrographs ntawm Te2 thiab ACC tau txais los ua cov duab mosaic (txhua tus tau txais los ntawm kev siv lub hom phiaj 10 ×). Axon terminals rau hauv BLA tau txheeb xyuas los ntawm kev siv 40 × lub hom phiaj ua z-pem ntawm 10 ntu, sib nrug 1 μm sib nrug (159 μm square; zoom feem, 1.0).
Rau cov tsiaj retrobeads-txhaj tshuaj uas underwent cFos immunolabeling, dluab tau txais ntawm 40 × magnification (159 μm square; zoom feem, 1.0) nrog 3 txawv lasers, sib xws rau lub ncov emission spectrum. rau DAPI (Nissl stain rau cell nuclei), AlexaFluor 488 (cFos), thiab Texas Liab (Retrobeads), feem. Tshooj ntawm 0.7 μm tau txais raws li 10-μm z-pawg. Tus naj npawb ntawm cov nuclei qhia cFos, hlaws-labeled, thiab ob-zoo (cFos + hlaws dai) tau suav rau txhua tus tsiaj hauv thaj av Te2 ntawm anteroposterior coordinates ntawm 6.7 mus rau 7.3 hli los ntawm bregma [10]. Cov ntaub ntawv tau muab nruab nrab los ua qhov nruab nrab ntawm txhua tus tsiaj thiab cov txiaj ntsig tau raug txheeb xyuas piv. Cov duab ntawm cov ntu nrog DAB staining ntawm Neun tau txheeb xyuas siv Neurolucida software txuas nrog lub tshuab tsom ntawm lub koob yees duab xim CCD [10].
Kev txheeb xyuas cov ntaub ntawv thiab cov txheej txheem cais tawm
Lub n rau txhua pab pawg tau tsim ib qho tseem ceeb raws li peb cov kev tshawb fawb yav dhau los [10,16,17], yav dhau los luam tawm ua haujlwm hauv daim teb (saib cov ntaub ntawv rau ACC [6,22,55] thiab Te2 [10,59]), thiab los ntawm G-power kwv yees, raws li cov lus hauv qab no (Table 1):
Rau txhua qhov kev tshuaj ntsuam, peb kwv yees tus lej kawg ntawm 8 txog 10 tsiaj rau txhua pab pawg. Cov pab pawg tau khiav nrog kev tswj sab hauv hauv tib qhov kev sim (S1 Table). Muab qhov sib txawv ntawm cov txheej txheem phais thiab kev coj tus cwj pwm, peb suav nrog qhov tseem ceeb ntawm cov kev sim ntau dua (txog li 15% ntau dua) uas qee qhov tau ntsib cov qauv kev sim thiab tau suav nrog, yog li zam kev txwv tsis pub suav nrog. Nyob rau hauv cov ntaub ntawv ntawm hippocampal kev tshawb fawb, los soj ntsuam cov teebmeem ntawm NMDA thiab CNQX txhaj tshuaj ntawm lub sij hawm sib txawv, peb sib npaug tag nrho cov tsiaj tswj ntawm lub tsheb thiab sham-ua cov nas ntawm ntau pawg.
Kev soj ntsuam tus cwj pwm, kev tshuaj xyuas histological, thiab suav ntawm tes tau ua qhov muag tsis pom. Tsiaj txhu uas muaj qhov chaw tsis txaus ntawm cov koob taug kev lossis qhov chaw kho mob nyob rau hauv rooj plaub ntawm NMDA-irreversible lesions raug tshem tawm los ntawm kev txheeb xyuas cov ntaub ntawv (S1 Table). Hauv kev tshawb fawb tshuaj, peb tsis suav nrog 57 tus tsiaj ntau dua li ntawm 465 tus tsiaj vim tias qhov kev tso koob tsis raug (22/255 rau Te2, 31/179 rau ACC, thiab 4/31 rau hippocampus). Hauv kev tshawb nrhiav tracing, ntawm 21 tus tsiaj, peb tshem tawm 3 yam uas kev txhaj tshuaj ntawm retrobeads plam BLA. Hauv kev tshawb fawb Te2 optogenetics, tshaj li tag nrho ntawm 30 tus tsiaj, peb tsis suav nrog 1 nas vim qhov kev tso kawm ntawm cov fibers optic tsis nyob saum thaj tsam lub hom phiaj, 1 nas. Tom qab tag nrho, tus kab mob no tsis tuaj hauv Te2, thiab 2 nas vim tias tus kab mob kis tau qis dua 4.7% thiab 5.3% ntawm thaj chaw Te2 ntawm qhov chaw txhaj tshuaj. Hauv cov nas suav nrog hauv kev txheeb cais, tus kab mob kis tsawg tsawg yog 39.6% ntawm qhov kev sib koom ua ke stereotaxic ntau dua thiab 50.2% ntawm qhov sib koom ua ke tom qab stereotaxic ntau dua.
Ib yam li ntawd, nyob rau hauv ACC optogenetics thwmsim, tshaj tag nrho ntawm 32 tsiaj, 2 nas raug tshem tawm vim qhov kev tso kawm ntawm optic fibers tsis nyob saum thaj tsam lub hom phiaj. Ob tus nas raug tshem tawm vim tias tus kab mob hauv ACC tsis tuaj, 1 tus tsiaj vim tias tus kab mob no nkag mus rau hauv cov kab mob thib ob uas nyob ib sab, thiab 1 nas vim tus kab mob kis tsawg dua 2.3% ntawm thaj chaw ACC ntawm qhov chaw txhaj tshuaj. Hauv cov nas uas tseem tshuav, qhov kis tus kab mob tsawg tsawg yog 33.3% ntawm qhov sib koom ua ke stereotaxic ntau dua thiab 42.2% ntawm kev sib koom ua ke tom qab ntau dua.
Hauv kev tshawb fawb NMDA qhov mob, cov kab mob feem ntau tsom rau thaj tsam CA1 ntawm dorsal hippocampus. Qhov tsawg kawg nkaus (liab) thiab qhov ntev tshaj plaws (liab liab) ntawm cov kab mob hippocampal nyob rau tag nrho cheeb tsam ntawm dorsal hippocampus yog feem ntau 23.2% thiab 53,5% ntawm qhov kev sib koom ua ke stereotaxic ntau dua thiab 28.3% thiab 62.3% ntawm kev sib koom ua ke tom qab ntau dua. Tshaj tag nrho ntawm 73 tus tsiaj, 4 nas raug tshem tawm vim qhov mob tsis tuaj, thaum muaj 3 tus tsiaj ntxiv raug muab pov tseg vim qhov txuas ntxiv ntawm cov kab mob tsawg dua 5.0% (xws li 4.8%, 4.3%, 3.1 %) hais txog thaj tsam hippocampal ntawm 2 lub koom haum.
Kev txheeb xyuas thaj tsam contour tau ua los ntawm kev tshuaj xyuas qhov muag thiab phau ntawv kom muaj nuj nqis siv cov cuab yeej hauv cheeb tsam-contour ntawm ZEN 3.0 software. Tom qab ntawd cov nqi ntawm cheeb tsam tau normalized nyob rau tag nrho cheeb tsam ntawm cheeb tsam. Stereotaxic kev tswj hwm ntawm Te2, ACC, thiab hippocampus tau ua raws li Paxinos atlas [26] thiab, nyob rau hauv cov ntaub ntawv ntawm Te2, nrog cortical teb refereed rau Zilles atlas [25].
Kev txheeb cais
Tag nrho cov ntaub ntawv raug nthuav tawm raws li txhais tau tias ± SEM. Tag nrho cov ntaub ntawv dhau Levene qhov kev xeem rau kev sib npaug ntawm qhov sib txawv. Yog li, parametric txheeb cais tau ua haujlwm thoob plaws txhua qhov kev sim. Cov ntaub ntawv los ntawm 2 pawg tau muab piv nrog siv 2-tailed unpaired Student t-tests. Kev sib piv ntau pab pawg tau raug soj ntsuam siv 1- txoj kev ANOVA xeem nrog Tukey's post hoc test. Txhawm rau hais txog qhov sib txawv ntawm cov pab pawg sib txawv, peb suav 3 × 2 sib xyaw tsim qauv ANOVA nrog ib pab pawg (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) raws li qhov nruab nrab- Cov ntsiab lus sib txawv thiab cov xwm txheej (ua ntej thiab tom qab tsis ntev los no txias + txhaj tshuaj) raws li cov hauv kev kawm sib txawv. Qhov twg pab pawg × kev sib cuam tshuam yog qhov tseem ceeb, peb tau ua qhov kev ntsuam xyuas cov txiaj ntsig tseem ceeb thiab peb tau kho txhua tus nqi nrog Bonferroni kho. Rau txhua tus qauv ANOVA sib xyaw, peb tau soj ntsuam qhov Sphericity assumption los ntawm Mauchly's Test of Sphericity.
Cov kev txheeb cais (piv txwv li, tus nqi tseeb ntawm n rau txhua pab pawg, SEM, qhov ntsuas ntsuas, qhov loj me, thiab qhov tseeb p-tus nqi) tau tshaj tawm hauv cov lus dab neeg. Rau qhov sib npaug ntawm cov qauv, qhov loj me rau qhov tsis sib xws t-kev ntsuam xyuas tau txiav txim siab los ntawm kev suav Cohen's d lossis Glass's d raws li qhov sib xws ntawm SDs thaum, rau cov qauv sib txawv, Hedges'g. Kev sib raug zoo ntawm cov xov tooj ntawm tes thiab khov tau suav nrog Pearson tus coefficient. Txhawm rau txiav txim siab seb cov ntaub ntawv puas ua tau raws li qhov kev xav ntawm kev txheeb cais, peb tsis lees paub qhov kev xav tsis zoo ntawm P < 0.05 qib. Txhua qhov kev txheeb xyuas kev txheeb xyuas tau ua tiav siv SPSS Statistics 22 (IBM).
Txhawb cov ntaub ntawv
S1 Fig. Magnification ntawm koob lem ntawm Te2 (A) thiab ACC cortex (B) txhaj nrog CNQX, xaiv ua piv txwv. (C) Thaum sawv cev nrog tib lub ntsiab lus 2 lub lis piam tom qab qhov txheej txheem, cov tsiaj tsuas yog poob siab tau pom tias tsis tshua muaj kev ntshai, qhia tau hais tias cov txheej txheem tsis tau ua kom txias txias hauv cov ntsiab lus uas qhov kev poob siab tau xa tuaj. (D) Cov txiaj ntsig zoo ib yam li hauv daim duab 1 tau los ntawm kev sib npaug ntawm 2 lub suab ua haujlwm raws li CSs (CS1, 3 kHz thiab CS2, 15 kHz) (Student t test, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Iav's d=4.14). (E) Nyob rau hauv cov ntxhiab tsw-CS conditioned nas khov rau cov tsw, 2 lub lis piam tom qab txias, yog siab txawm tias sim nyob rau hauv ib tug txawv ib puag ncig hais txog lub conditioning ntsiab lus, yog li qhia tau hais tias kev ntshai tshwj xeeb yog txuam nrog rau cue xa. Scale bar, 300 μm. ��P <0.01. Tag nrho cov ntaub ntawv yog txhais tau tias thiab SEM. Cov ntaub ntawv xaus rau S1 Fig tuaj yeem pom hauv cov ntaub ntawv txhawb nqa hauv cov ntaub ntawv npe S1 Txhawb Cov Ntaub Ntawv. (TIF)
S2 Fig. CNQX txhaj tshuaj cuam tshuam qhov kev cia siab ntawm kev hnov lus tsis ntev los no ntawm kev ntshai kev nco hauv cov nas uas ntshai kev nthuav dav tau txo qis los ntawm lub suab ib leeg ua ntej raug lossis los ntawm kev siv lub suab nrov dawb li CS1. A 3 × 2 mix-design ANOVA (qhov tseem ceeb ntawm pawg: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η{12}}. 236, main effect of condition: F(1,42)=0.161, p=0.691, η{20}}.004, group × mob kev sib cuam tshuam F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) pom tias khov rau 3 kHz suab nrov ua ntej nws koom nrog hauv Teb Chaws Asmeskas qis dua nyob rau hauv cov tsiaj uas tau txais 15 kHz tone pre-exposure ua ntej lub 15 kHz-US khub (n=10, p=0.001) los yog nyob rau hauv nas conditioned mus rau lub suab nrov (n=13) , p=0.008) piv rau CS1-CS2 tsiaj (n=22) uas qhia tau hais tias muaj kev ntshai hloov pauv dav dav teb. Txawm li cas los xij, tom qab CS-US kev kawm thiab kev txhaj tshuaj cnqx hauv Te2 cortex, tsis ntev los no kev ntshai nco tau cuam tshuam rau txhua pawg (p> 0.05). Cov txiaj ntsig tseem ceeb hauv pawg (ua ntej thiab tom qab CS-US kev kawm ua raws li kev txhaj tshuaj cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tone-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Tag nrho cov ntaub ntawv yog txhais tau tias thiab SEM. Cov ntaub ntawv xaus rau S2 Fig tuaj yeem pom hauv Kev Txhawb cov ntaub ntawv hauv cov ntaub ntawv npe S1 Txhawb Cov Ntaub Ntawv. (TIF)
S3 Fig. (A) Random piv txwv ntawm retrobeads txhaj hom phiaj BLA. (B thiab C) Piv txwv ntawm qhov chaw kho qhov muag fiber ntau saum BLA ntawm cov tsiaj txhaj tshuaj AAV vectors hauv Te2 (B) thiab ACC cortex (C). Scale bar, 500 μm.
Kev lees paub
Peb ua tsaug rau Dr. E. Manassero rau lawv txoj kev txhawb nqa thiab cov lus qhia tas mus li.
Sau Kev Pab Txhawb
Conceptualization: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.
Cov ntaub ntawv curation: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.
Kev tsom xam: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.
Kev nrhiav nyiaj txiag: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.
Kev Tshawb Fawb: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.
Txoj kev: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.
Saib xyuas: Benedetto Sacchetti.
Kev lees paub: Benedetto Sacchetti.
Sau - thawj daim ntawv sau: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.
Sau - tshuaj xyuas & kho: Annamaria Renna, Luisella Milano.
Cov ntaub ntawv
1. Frankland PW, Bontempi B. Lub koom haum ntawm kev nco tsis ntev los no thiab tej thaj chaw deb. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217
2. Dudai Y. Lub neurobiology ntawm consolidations, los yog, yuav ruaj khov npaum li cas? Annu Rev Psychol. 2004; 55:51–{4}. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210 PAB
3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Nco kev sib sau. Txias Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7 ua. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360 ib
4. Alvarez P, Squire LR. Memory consolidation thiab medial temporal lobe: ib qho yooj yim network qauv. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91: 7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742 ib
5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Vim li cas thiaj muaj kev kawm ntxiv hauv hippocampus thiab neocortex: kev nkag siab los ntawm kev ua tiav thiab kev ua tsis tiav ntawm cov qauv kev sib txuas ntawm kev kawm thiab kev nco. Psychol Rev. 1995; 102: 419–457 : kuv.
For more information:1950477648nn@gmail.com
